Руководитель проекта: Тойшибеков Ержан Макенович
Срок реализации: 2024 — 2026 гг.
ИРН: AP23488891
О ПРОЕКТЕ
Идея проекта заключается в изучении фундаментальных аспектов клонирования снежного барса (Panthera uncia). В проекте планируется сравнение двух методов клонирования: метод Handmade cloning и метод клонирования с использованием микроманипуляторов (Piezo Drill). Для клонирования эмбрионов предполагается использование энуклеированных яйцеклеток домашних кошек (Felis catus) и заморожено-оттаянных соматических клеток снежного барса в качестве доноров ядер. Также планируется изучить развитие клонированных эмбрионов и их выживаемость после витрификации.
Мультидисциплинарность проекта заключается в том, что используемые методы клонирования относятся к различным областям науки: биология, биология клетки, эмбриология, вспомогательные репродуктивные технологии, биотехнология и криобиология. Реализация проекта позволит изучить возможность использования iSCNT-метода для сохранения биоразнообразия генетических ресурсов животного мира Казахстана.
Объект исследований – замороженные соматические клетки кожи взрослого снежного барса (Panthera uncia).
Актуальность
В настоящее время возникает неотложная потребность в изучении научных основ рационального использования соматических клеток (фибробластов), хранимых в криобанке. Необходимо отметить, что объектом исследования в проекте является исчезающий вид — снежный барс (Panthera uncia), включенный в Международную Красную книгу. Его изучение на разных уровнях позволяет нашей стране внести значительный вклад в сохранение биологического разнообразия редких видов.
Проект предполагает не только сохранение данного вида в условиях зоопарков, но и хранение замороженной гермоплазмы. Научная инновация данного проекта состоит в исследовании фундаментальных аспектов клонирования снежного барса (Panthera uncia) применением метода межродового переноса ядер соматических клеток с использованием криосохраненных соматических клеток снежного барса и энуклеированных яйцеклеток домашних кошек и изучения выживаемости витрифицированных клонированных эмбрионов. На момент данного исследования в Казахстане аналогичные работы не проводились.
Цель проекта
Изучение фундаментальных аспектов межродового переноса ядер соматических клеток снежного барса (Panthera uncia) в энуклеированные яйцеклетки кошек (Felis catus) для криосохранения биоразнообразия животного мира.
Задачи проекта
1. Изучение воздействия различных составов культуральной среды на созревание in vitro незрелых яйцеклеток домашних кошек (IVM, in vitro maturation). Исследование воздействия разных компонентов в составе среды: FSH, LH, сывороточного альбумина, на дозревание in vitro яйцеклеток домашних кошек (in vitro maturation).
2. Отработка метода удаления zona pellucida яйцеклеток. Изучение воздействия разных концентраций гиалуронидазы на денудацию яйцеклеток домашних кошек (не менее 100 штук).
3. Изучение эффективности разных концентраций демеколцина в составе среды на удаление пронуклеуса яйцеклеток домашних кошек.
4. Исследование эффективности применения метода удаления пронуклеуса яйцеклеток и переноса ядра соматических клеток с использованием микроманипуляторов.
5. Исследование эффективности микрохирургического метода удаления пронуклеуса зрелых яйцеклеток кошек для формирования цитопластов — методом Hand Made Cloning и методом с использованием микроманипуляторов (Piezo Drill).
6. Изучение воздействия разных сочетаний электрического тока и химического метода для слияния цитопластов и соматических клеток. Изучение воздействия 3-х разных сочетаний постоянного тока (DC) и разные концентрации фитогемагглютинина (PHE) на слияние цитопластов домашних кошек и соматических клеток снежного барса.
7. Исследование воздействия кальций ионофор (Ca Inophore) и его разных концентраций на развитие клонированных эмбрионов и экстракта сперматозоидов на активацию клонированных эмбрионов.
8. Исследование воздействия разных методов in vitro культивирования на ход развития клонированных эмбрионов (in vitro culture). Исследование воздействия двух разных методов in vitro культивирования: выращивание в СО2-инкубаторе и выращивание с применением Погружной Инкубационной Системы (Submarine Incubation System, SIS).
9. Исследование жизнеспособности клонированных зародышей после in vitro культивирования до стадии развития бластоциста.
10. Исследование жизнеспособности клонированных зародышей после витрификации при температуре -196 0С.
11. Исследование жизнеспособности клонированных зародышей после ультрабыстрой витрификации при температуре -205ОС.
12. Подготовка методических рекомендаций для яйцеклеток домашних кошек по in vitro созреванию (IVM) и in vitro культивированию (IVC). Публикация статей в зарубежных рецензируемых научных журналах в соответствии с требованиями конкурсной документации в области естественных наук для фундаментальных исследований.
Ожидаемые результаты
- Будут изучены фундаментальные аспекты межродового переноса ядер соматических клеток снежного барса (Panthera uncia) в энуклеированные яйцеклетки кошек (Felis catus) для криосохранения биоразнообразия животного мира и изучена выживаемость клонированных эмбрионов после витрификации и ультрабыстрой витрификации (VitMaster vitrificator).
- Будет оптимизирован состав культуральной среды для эффективного дозревания яйцеклеток домашних кошек in vitro с определением оптимальных концентраций FSH, LH и сывороточного альбумина.
- Будет отработан эффективный метод удаления zona pellucida с использованием гиалуронидазы и разработана методика удаления пронуклеуса с применением демеколцина. Планируется сравнить эффективность различных методов переноса ядер, включая микроманипуляторы (Piezo Drill) и ручной метод (Hand Made Cloning).
- Будут определены оптимальные параметры электрического тока и концентрации фитогемагглютинина для слияния цитопластов кошки с соматическими клетками снежного барса.
- Будет исследовано влияние кальций-ионофора и экстракта сперматозоидов на активацию клонированных эмбрионов.
- Будет проведена сравнительная оценка двух методов культивирования (традиционный CO₂-инкубатор и система SIS), что позволит выявить наиболее эффективный метод для развития эмбрионов до стадии бластоцисты.
- Будут изучены методы криоконсервации, включая медленную витрификацию при -196°C и ультрабыструю заморозку при -205°C, с оценкой жизнеспособности эмбрионов после оттаивания.
- По итогам исследований будут подготовлены методические рекомендации по in vitro созреванию и культивированию яйцеклеток домашних кошек, а также опубликованы научные статьи в рецензируемых международных журналах.
ИСПОЛНИТЕЛИ ПРОЕКТА:
Тойшибеков Ержан Макенович – д.б.н., ассоциированный профессор, главный научный сотрудник лаборатории криобиологии и биобанка гермоплазмы диких животных Казахстана. ORCID ID: 0000-0001-6060-0612, Researcher ID: K-5014-2019, Scopus Author ID: 54880591400, h-index 3
Нуркенов Туленды Тулешевич – PhD, заведующий лабораторией криобиологии и биобанка гермоплазмы диких животных Казахстана. ORCID ID: 0000-0002-9391-2214, Scopus Author ID: 57330786200, h-index 1
Грачев Алексей Александрович – магистр естественных наук, и.о. заведующего лабораторией териологии. ORCID ID 0000-0001-6051-8299, Scopus Author ID: 57873983000, h-index 2
Сальменова Мадина Еркеновна – магистр биологии, научный сотрудник лаборатории криобиологии и биобанка гермоплазмы диких животных Казахстана. ORCID ID 0000-0002-4839-9706, h-index 0
Тойшыбек Дінмұхамед Ержанұлы – бакалавр биологии, младший научный сотрудник лаборатории криобиологии и биобанка гермоплазмы диких животных Казахстана. ORCID ID 0000-0002-5664-3289, Scopus Author ID: 57204921230, h-index 1
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТ
(по итогам 2024 года)
Изучили воздействие различных составов культуральной среды на созревание in vitro незрелых яйцеклеток домашних кошек (IVM, in vitro maturation), а также воздействие разных компонентов в составе среды: фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), сывороточного альбумина, на дозревание in vitro яйцеклеток домашних кошек (in vitro maturation), разных концентраций гиалуронидазы на денудацию яйцеклеток домашних кошек.
Отработан метод удаления zona pellucida яйцеклеток. Изучена эффективность применения метода удаления пронуклеуса яйцеклеток и переноса ядра соматических клеток с использованием микроманипуляторов Narishige (Piezo Drill).
Результаты проекта внесут значительный вклад в развитие методов вспомогательных репродуктивных технологий для сохранения редких видов кошачьих.